- 转化医学以药物研发过程中生物标志物为核心,以精准医疗提高药物研发临床应答率为目标,覆盖从早期靶点确认——临床前R&D ——临床I、II、III期Development,到上市后的药物检测,通过不同阶段的研究实现药物研发的闭环。
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- 04临床研究
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随着基因组学、蛋白质组学和代谢组学等多组学分析技术不断地发展,治疗方式已经从传统小分子扩展到多肽、蛋白、抗体、基因疗法、细胞疗法等多种新型技术。尽管有这些新技术,但仍有大量疾病的致病原因还无法彻底明白。转化医学将生物医学观察和研究转化为改善健康的干预措施的过程,加速了基础研究、新药开发的和临床转化的进程,成为精准靶向治疗的加速器。转化医学研究利用各种研究手段,确定靶点与疾病发生发展的关系、验证和探索药物的作用机制、发现生物标志物并开发伴随诊断产品,以及为临床研究开展筛选最合适的人群和适应症等,从而提高新药研发效率和成功率。将转化医学里程碑叠加到药物开发阶段[1]合乐HL8请回答:什么是转化医学
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- 免疫组化简介免疫组化,也称免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。是指应用免疫学基本原理即抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及相对定量的研究。根据抗原抗体反应和化学显色的原理,组织切片或细胞样本中的抗原先和一抗结合,再利用一抗与二抗反应,DAB进行显色,进而进行分析。主要步骤组织处理、固定、切片抗原修复除去内源性过氧化物酶封闭一抗、二抗孵育检测复染
- 组织处理、固定、切片组织固定可保存抗原,防止采集的组织自溶和坏死。组织包埋可在切片过程中对组织提供支撑,使切片更坚实。
石蜡切片 冰冻切片 固定 包埋前:甲醛 切片前或切片后:甲醛、甲醇、乙醇或丙酮 切片 切片机 冰冻切片机 储存 室温下储存多年 -80 °C下储存1年 (-190°C下储存时间更长) 优势 容易操作,不会损坏切片 ♦ 保留酶的功能和抗原性
♦ 实验流程简短(通常不需要冗长的固定步骤)
局限性 ♦ 过度固定会掩盖抗原表位,进而增加抗原修复的需求
♦ 处理时间长:在梯度酒精和二甲苯中逐步脱水,以便于石蜡渗透。
♦ 如果没有快速冷冻组织”可能会形成冰晶,从而破坏组织结构
♦ 冰冻切片通常比石蜡切片厚,可能会导致分辨率低、图像差
♦ 可能需要阻断内源活性酶。
石蜡切片 vs冰冻切片 - 处理流程
- 抗原修复对甲醛固定的组织切片进行抗原修复,以暴露抗原位点,从而使抗体结合。
热诱导的抗原表位修复 蛋白水解酶诱导的抗原表位修复 优势 抗原表位的修复更温和,参数更可控。 适用于较难修复的抗原表位。 ph值 通常使用pH6的缓冲液,但碱性缓冲液也在广泛使用。必须通过实验确定 pH值通常为7.4。 温度 约95°C。 通常为37°C 孵育时间 10-20分钟 10-15分钟 缓冲液组分 取决于靶抗原所需的pH 值。常用的缓冲液包括柠檬酸钠、EDTA和Tris-EDTA 酶(如胃蛋白酶、蛋白酶K 或胰蛋白酶)的中性缓冲液。 注意事项 微波炉加热可能会导致抗原修复不均匀。剧烈沸腾会导致脱片(组织与载玻片分离)。 酶修复有时会破坏切片的形态- 浓度和时间需要优化 抗原修复的主要方法 - 封闭用血清或BSA封闭,防止抗体的非特异性结合,并降低背景和潜在的假阳性结果。❖ 蛋白封闭:使用血清或BSA 进行封闭对于防止抗体与组织或Fc 受体(与抗体恒定区(Fc)结合的受体)发生非特异性结合至关重要。二抗种属来源的血清是很好的封闭试剂。使用牛血清白蛋白(BSA)或酪蛋白,可用于阻断非特异性抗体结合。❖ 生物素封闭:在使用基于亲和素/生物素的检测系统时,阻断内源性生物素,因为内源性生物素存在于许多组织中,特别是肾脏、脾脏、肝脏和大脑中。用亲和素与组织孵育,阻断内源生物素,然后用外源生物素孵育,以阻断亲和素分子上额外的生物素结合位点。
- 检测❖ 酶显色法:显色检测使用酶能够催化可溶性底物产生有色沉淀。这些酶通常偶联在二抗上,也可以偶联在一抗上用于直接检测。最常用的酶有HRP 和AP,前者将DAB 转化成棕色产物,后者将3-氨基-9-乙基咔唑 (AEC) 转化成红色产物。显色检测通常比荧光检测更灵敏。此外,不同于荧光染料,有色沉淀物有光稳定性,因此染色切片能够保存多年。荧光检测需要使用专业荧光显微镜和滤光片,显色检测仅需使用标准显微镜。然而,显色检测的孵育和封闭步骤比荧光法更多,时间也更长。❖ 荧光法:荧光检测(免疫荧光)是基于荧光基团被特定波长的光激发后发射波长较长的荧光的特性。荧光检测常常用于需要同时检测多种抗原的情况。荧光染料可以与一抗或二抗直接偶联,也可与链霉素亲和素偶联。
- 案例赏析:PD-L1, Ki-67, Her2, CD31, CD163, FoxP3IHC Analysis of the expression ofa)PD-L1 from lung adenocarcinoma[3]; b)Ki-67 from periampullary tumors[4]; c)Her2 from lung tumor[5]; d)CD31 from human gastric adenocarcinoma[6]; e)CD163 (M2 TAM marker) from oral squamous cell carcinoma (OSCC)[7]; f)FoxP3 from human glioblastoma[8].
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- 基于基因组学、蛋白组学、细胞组学及病理组学等综合性转化医学平台;高质量的研发管理团队;合乐HL8转化医学平台致力于为全球合作伙伴提供全方位生物标志物发现、靶点验证、伴随诊断开发与商业化检测等一体化解决方案。❖ 以ELISA、ECL(MSD), SIMOA(HD-X), Biacore 8K 技术构建的的蛋白质相互作用,蛋白水平生物标志物平台;❖ 以流式细胞术(BD Symphony A3,BD Fortesssa, Beckman CytoFLEX S)为主构建的细胞水平生物标志物平台;❖ 以荧光定量PCR技术构建的多重核酸水平生物标志物平台;❖ 免疫组化(TAMs-IHC,FISH)技术构建的病理水平生物标志物平台等。
- 参考文献:[1] Hugues Dolgos, et al. Translational Medicine Guide transforms drug development processes: the recent Merck experience. Drug Discov Today. 2016 Mar;21(3):517-26. doi: 10.1016/j.drudis.2016.01.003.[2] Ying Xu, et al. A Selective Small-Molecule c-Myc Degrader Potently Regresses Lethal c-Myc Overexpressing Tumors. Adv Sci (Weinh). 2022 Mar;9(8):e2104344. doi: 10.1002/advs.202104344.[3] Jonas J Heymann, et al. PD-L1 expression in non-small cell lung carcinoma: Comparison among cytology, small biopsy, and surgical resection specimens. Cancer Cytopathol. 2017 Dec;125(12):896-907. doi: 10.1002/cncy.21937.[4] Mark M Aloysius, et al. Predictive value of tumor proliferative indices in periampullary cancers: Ki-67, mitotic activity index (MI) and volume corrected mitotic index (M/V) using tissue microarrays. World J Surg. 2010 Sep;34(9):2115-21. doi: 10.1007/s00268-010-0681-3.[5] Montse Verdu, et al. Cross-reactivity of EGFR mutation-specific immunohistochemistry assay in HER2-positive tumors. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 2015 Sep;23(8):565-70.[6] Qingling Wang, et al. EPCR promotes MGC803 human gastric cancer cell tumor angiogenesis in vitro through activating ERK1/2 and AKT in a PAR1-dependent manner. Oncol Lett. 2018 Aug;16(2):1565-1570. doi: 10.3892/ol.2018.8869.[7] Faustino J Suárez-Sánchez, et al. Macrophages in Oral Carcinomas: Relationship with Cancer Stem Cell Markers and PD-L1 Expression. Cancers (Basel) (IF: 6.13; Q1). 2020 Jul 2;12(7):1764. doi: 10.3390/cancers12071764.[8] Qi Yue, et al. The prognostic value of Foxp3+ tumor-infiltrating lymphocytes in patients with glioblastoma. J Neurooncol. 2014 Jan;116(2):251-9. doi: 10.1007/s11060-013-1314-0. Epub 2013 Nov 26.[9] Christopher P Austin.Opportunities and challenges in translational science. Clin Transl Sci. 2021 Sep;14(5):1629-1647. doi: 10.1111/cts.13055.